ProBio：CircRNA白皮书-从序列设计到GMP生产：破局环状RNA产业化瓶颈（10页）.pdf

1、ProBioCDMO.cnWHITE PAPER从序列设计到GMP生产：破局环状RNA产业化瓶颈一、为何选择环状RNA？超越线性RNA的优势 环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的单链RNA分子，其3和5端共价连接，形成无游离末端的完整环形结构。CircRNA独特的结构赋予了其超越传统线性mRNA的稳定性，其非凡的稳定性源于对核酸外切酶降解的抗性，使其半衰期显著延长，为长效蛋白表达奠定基础；同时，其闭合结构有助于避免被宿主模式识别受体（如RIG-I）识别，从而显著降低先天免疫反应，提升治疗安全性1。目前，环状RNA技术已经全面迈入临床验证期，证明了其可行性。基于CircRNA

2、结构所赋予的独特优势，其已成为新一代RNA技术。它不仅能实现持久、安全的治疗性蛋白表达，还可被设计为高效miRNA海绵或稳定RNA适配体，用于调控基因网络或干预疾病通路。近期，该技术在体内CAR-T治疗领域取得了突破性进展。体外CAR-T细胞疗法需要个体化采集、细胞体外扩增和回输，流程漫长（3-6周）且成本高昂，极大限制了其治疗可及性。相比之下，基于CircRNA的体内CAR-T技术，利用其长效、稳定表达的特性，通过非病毒递送系统即可直接在患者体内原位生成CAR-T细胞。这一治疗策略展现出生产周期短，生产成本低，易于规模化生产，安全性优，可及性高等突出优势。目前，基于CircRNA的体内CAR

3、-T技术应用于自身免疫性疾病，B细胞恶性肿瘤等模型的最新研究数据，全面展示了CircRNA的应用潜力2。CircRNA有望为更广泛疾病的预防与治疗带来突破性进展。1 从序列设计到GMP生产：破局环状RNA产业化瓶颈图1.CircRNA和mRNA降解途径CircRNA DecaymRNA Decay二、CircRNA面临的双重设计挑战：体外环化策略与蛋白翻译效率 目前，为满足生物医学研究和临床应用的需求，CircRNA的体外环化技术已发展出多种方法，主要包括酶法连接和核酶剪接法两大技术路线。酶法连接 该方法是一种经典的体外环化方法。通过DNA或RNA夹板（splint）序列引导，利用T4 DNA

4、连接酶或T4 RNA连接酶催化线性RNA前体的5-磷酸末端和3-羟基末端形成磷酸二酯键3。然而，其连接效率极易受RNA二级结构影响，导致长链RNA分子（1000 nt）的环化效率通常较低，且易产生分子间连接的副产物，因此更适用于短链RNA的环化。核酶剪接法 该方法（I型及II型内含子系统）模拟了天然的自剪接机制。通过核酶的特殊向导序列，使剪接位点在空间上相互靠近，实现精准环化。相对于酶法连接，核酶剪接法无需蛋白质酶的参与，可显著降低CircRNA生产成本。同时，该方法能够实现长链RNA的高效环化。因此，目前核酶剪接法已成为优选的CircRNA体外合成策略。由于核酶自身的折叠构象容易受到目的环化

5、序列干扰，导致环化效率不稳定，通用的优化策略为在剪接位点与目标环化序列之间插入间隔和底物增强序列以消除干扰4，从而实现环化效率提升，但这种设计方式会引入外源性的核酸序列，容易引发宿主先天免疫反应5,6。一种改良的核酶剪接法“无痕环化策略”通过将环化位点设计在目标环化序列中，从而完全消除外源性疤痕序列，但这种环化策略由于核酶缺乏间隔序列和底物增强序列的保护，其附近复杂的局部二级结构不利于核酶的正确折叠，导致核酶失去剪接活性，因此其环化率往往不稳定7。针对上述技术瓶颈，ProBio体外环化平台构建了一个由自有环化专利技术驱动的全面的环化体系，提供三种体外环化解决方案，可精准匹配不同阶段与场景的应用

6、需求。ProBioCDMO.cn21.CircRNA体外环化策略：挑战与ProBio解决方案图2.核酶剪接法技术路线 有痕环化方案：基于成熟的自剪接自环化机制，通过引入底物增强序列提高环化率与稳健性。ProBio通过序列优化尽可能缩短底物增强序列的长度（可缩短至60%），经纯化后circRNA纯度（PA800检测）可大于85%。与mRNA相比，经规模化生产的circRNA蛋白表达更高效，表现出更长的蛋白表达窗口（图6）。案例1.CircRNA序列从头设计与工艺放大Purity of CircRNA(A)(B)CircRNA In Vitro ExpressionCircularization