1、恩泽康泰基于超速离心与多维表征方法对不同来源的细胞外囊泡进行高效纯化与质量控制恩泽康泰 Eppendorf HORIBA 三方技术协同应用白皮书2目录摘要.3行业背景与核心挑战.3材料与方法.4 细胞外囊泡来源.4 协同方式与核心技术.4 细胞外囊泡纯化工艺流程.5 细胞外囊泡表征方法.8结果与讨论.10 关键结果与发现.10 细胞外囊泡透射电镜图.11 细胞外囊泡颗粒尺寸及分布.12 细胞外囊泡颗粒浓度与纯度.13 细胞外囊泡表面蛋白标记物.14 细胞外囊泡 Zeta 电位.15 细胞外囊泡拉曼光谱分析.16选型指南.18展望.19致谢.19参考文献.193行业背景与核心挑战细胞外囊泡尺寸相

2、对较小（30-150nm），可在细胞之间转移核酸、蛋白质、酶和脂质等生物大分子，是细胞间通讯的重要模式。此外，它们可以用作各种疾病的生物标志物，也可以作为下一代治疗药物的天然递送载体系统。与常用的药物载体（如脂质体、无机介孔材料）相比，细胞外囊泡具有更好的生物相容性、靶向性、低毒性和高传递效率，且无材料聚集引起的副作用，是极具前景的药物载体【1】。植物来源的细胞外囊泡样纳米颗粒（PELNs）是一类从植物组织中分离得到的膜性囊泡。大多数 PELNs 可食用，并能作为无毒副作用的药物递送载体。通常动物细胞外囊泡产量低、来源有限且有一定免疫原性，相比于此，植物 PELNs 来源广泛、产量高、免疫原性

3、低，因而也逐渐成为研究热点。【2】细胞外囊泡广泛存在于各种体液中，能够稳定携带母细胞的重要生物信息。通过分离和分析血浆、血清、尿液、唾液等体液中的 EV，可以捕获细胞分子特征，监测生理或病理状态，尤其是通过细胞外囊泡蛋白。因此，细胞外囊泡有望成为疾病诊断与预后评估的重要指标来源。常用 EV 分离方法包括超速离心、蔗糖密度梯度离心、免疫亲和捕获、聚合物沉淀、尺寸排阻色谱(SEC)和微流控技术等。超速离心作为最常用的细胞外囊泡纯化技术，被约半数研究者所采用。它基于细胞外囊泡与杂质密度和粒径的差异进行分离。具有技术成熟、适合大多数样本、成本低等特点。密度梯度离心可利用两种或多种不同密度的分离介质（如

4、蔗糖、碘克沙醇），分离纯度更高，但操作繁琐、耗时更久（16 小时）。【3】蔗糖垫超速离心法相比于差速离心可获得更高纯度和更均一的 细胞外囊泡【4】。大规模细胞外囊泡生产仍面临回收率和纯度提升、成本控制等挑战。结合超滤、聚合物沉淀、超速离心和 SEC 等多种方法，可实现 GMP 级生产。大规模生产和严格质量控制体系对于细胞外囊泡的临床转化至关重要。根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）的建议，EV 表征需实现三个目标：证实 EV 存在、估算 EV 数量、评估非 EV 组分对 EV 制备物的贡献【5】。理想情况下，细胞外囊泡制剂的表征应包括细胞外囊泡浓度、颗粒尺寸分布、形态、特定生物标志物的富集程度和

5、纯度等方面。EV 的形态学可通过高分辨率成像技术进行评估，包括扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、冷冻电镜（cryo-EM）以及扫描探针显微镜（SPM）。纳米颗粒跟踪分析（NTA）作为一种基于布朗运动的溶液中囊泡和颗粒定量方法，是 EV 领域广泛用于估算颗粒大小和浓度的光学技术【10】。通常，细胞外囊泡的组成因其来源细胞的不同而有所差异。常见蛋白几乎存在于所有细胞外囊泡中，如与膜转运和融合相关的蛋白（Rab、GTP 酶、flotillin）、多泡体合成相关蛋白（Alix、TSG101）、四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、细胞骨架蛋白（热休克蛋白、肌动蛋白、微管

6、蛋白）。因此，可以通过检测这些常见蛋白来确认细胞外囊泡的存在。【3】摘要细胞外囊泡（EV）作为下一代疾病诊断标志物与药物递送载体，其临床转化正面临“规模化制备”与“标准化质控”的行业性瓶颈。传统方法在效率、一致性与综合评价上的不足，已成为产业发展的核心障碍。本白皮书首次系统性展示了由恩泽康泰、Eppendorf（艾本德）与HORIBA（堀场）构建的“EV一体化解决方案”（Extraction,Verification,Validation）。该方案并非技术的简单叠加，而是针对产业化需求的深度重构：样品预处理与闭环的验证：恩泽康泰提供从复杂样本（如血浆）预处理、标志物验证（WB）到最终生物学解释